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實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR)，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。通常我們會(huì)重點(diǎn)關(guān)注Ct值（Cycle threshold ，Ct），其含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。其原理如下：
1、TaqMan熒光探針：
PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成全同步。
2、SYBR熒光染料：
在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加全同步。
熒光染料也稱DNA結(jié)合染料，目前主要使用的染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I能與DNA雙鏈的小溝特異性的結(jié)合，游離的SYBR Green I幾乎沒有熒光信號(hào)，但結(jié)合雙鏈DNA后，其熒光信號(hào)可呈數(shù)百倍的增加。隨PCR產(chǎn)物的增加，PCR產(chǎn)物與染料的結(jié)合量也增大，其熒光信號(hào)強(qiáng)度代表雙鏈DNA分子的數(shù)量。
我們將這條熒光擴(kuò)增曲線人為地分為基線期、指數(shù)擴(kuò)增期和平臺(tái)期三個(gè)階段:
1、基線期，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所覆蓋，我們無法判斷熒光強(qiáng)度的變化。
2、擴(kuò)增期，熒光信號(hào)呈指數(shù)增長，擴(kuò)增產(chǎn)物的量與起始模板量存在線性關(guān)系，在此階段可定量分析。
3、平臺(tái)期，由于底物耗盡等因素.熒光信號(hào)不再呈指數(shù)增加。
RT-qPCR原理的三個(gè)主要步驟：
1 反轉(zhuǎn)錄：
使用逆轉(zhuǎn)錄酶和特定引物將RNA樣品反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
該步驟將RNA模板轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定且可擴(kuò)增的DNA形式。
反轉(zhuǎn)錄過程中使用特定引物。
2 、PCR擴(kuò)增：
使用特定引物對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這些引物環(huán)繞目標(biāo)區(qū)域。
PCR是一個(gè)循環(huán)過程，呈指數(shù)級擴(kuò)增DNA模板的數(shù)量。
PCR反應(yīng)中包含熒光染料或探針，它們結(jié)合到擴(kuò)增的DNA序列上并發(fā)出熒光信號(hào)。
3 、熒光實(shí)時(shí)檢測：
使用實(shí)時(shí)PCR儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號(hào)。
熒光的數(shù)量與每個(gè)PCR循環(huán)中擴(kuò)增的DNA數(shù)量成比例。
使用專業(yè)軟件分析數(shù)據(jù)以確定循環(huán)閾值（Ct）值，該值表示熒光信號(hào)達(dá)到特定閾值水平所需的循環(huán)數(shù)。Ct值用于計(jì)算原始樣品中存在的目標(biāo)DNA量，從而允許進(jìn)行基因表達(dá)或病毒載量等定量分析。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中有幾個(gè)重要的概念，包括擴(kuò)增曲線、基線、熒光閾值和域值循環(huán)數(shù)。
1、擴(kuò)增曲線（amplification curve）:
是在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中監(jiān)測到的熒光信號(hào)隨著循環(huán)數(shù)變化而繪制的一條曲線。在進(jìn)行PCR反應(yīng)過程中，通過檢測系統(tǒng)對PCR管內(nèi)的樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，最后將熒光信號(hào)值通過成像技術(shù)顯現(xiàn)在計(jì)算機(jī)上。正常的擴(kuò)增曲線包括四個(gè)階段：基線期、指數(shù)增長期、線性增長期、平臺(tái)期。
2、基線（baseline）：
是背景曲線的一段，在擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里熒光信號(hào)變化不大，接近一條直線。
3、熒光閾值（threshold）：
是在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期設(shè)定的一個(gè)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn)）。熒光閾值可以設(shè)定在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。
4、閾值循環(huán)數(shù):
表示每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，研究表明，各模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，即起始拷貝數(shù)越多，CT值越小;起始拷貝數(shù)越少,CT值越大。我們利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可做出以起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo),CT值為縱坐標(biāo)的一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。只要獲得未知模板的CT值,即從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該模板的起始拷貝數(shù)。
