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獲取純化原代細(xì)胞方法合集
點擊次數(shù):947 更新時間:2023-06-27

    原代細(xì)胞分離的方法有多種,常用的是機械解離細(xì)胞法、酶學(xué)解離細(xì)胞法以及螯合劑解離細(xì)胞法,下面我們就介紹酶解聚方法獲得純化的原代細(xì)胞。

1、胰蛋白酶 純化法

1)、在去除不需要的組織后,使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4 mm小片,通過懸浮在無鈣鎂的平衡鹽溶液中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀,去除上清液。重復(fù)清洗2到3次。

2)、將盛有組織碎片的容器置于冰上,去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶(100 mg組織加入1ml 胰蛋白酶)。

3)、在4℃孵育6到18小時,使幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進去。

4)、移棄組織碎片中的胰蛋白酶,在37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30分鐘。

5)、在組織碎片加入熱的*培養(yǎng)基,用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養(yǎng)基,要加入大豆胰蛋白酶抑制劑。

6)、通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)(100~200 mm)過濾,分散所有剩余組織。計數(shù)和接種細(xì)胞,進行培養(yǎng)。


2、膠原酶純化法

1)、用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片,用Hanks'平衡液(HBSS)清洗組織碎片幾次。

2)、加入膠原酶(50~200單位/ml,溶解在HBSS中)。

3)、在37℃孵育4到18小時。加入3mM CaCl2增加解離效率。

4)、通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液,以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚,在碎片中加入新鮮的膠原酶。

5)、通過離心在HBSS中清洗懸液幾次。

6)、再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞,計數(shù)和接種細(xì)胞,進行培養(yǎng)。


3、Dispase純化法

1)用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片,用不含鈣鎂的平衡鹽溶液清洗組織碎片幾次。

2)、加入Dispase(0.6~2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液)

3)、在37℃孵育20分鐘到幾個小時。

4)、通過無菌不銹鋼絲網(wǎng)或尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液,以分離分散細(xì)胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚,在碎片中加入新鮮的Dispase。

5)、通過離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。

6)、再一次在培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞,計數(shù)和接種細(xì)胞,進行培養(yǎng)。


分離細(xì)胞后,首ci 傳代需要注意的問題:

1)、傳代培養(yǎng)時先觀察細(xì)胞的活性。

2)、細(xì)胞的活率應(yīng)該超過90%,密度控制在80%左右

3)、對于無血清培養(yǎng)基,需要降低胰蛋白酶使用量。

(1)、 移棄使用過的細(xì)胞培養(yǎng)基。

(2)、使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA清洗細(xì)胞。在培養(yǎng)瓶背著細(xì)胞的一面加入清洗溶液,通過轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶1到2分鐘清洗細(xì)胞層,然后去除清洗液。

(3)、加入胰酶消化,消化細(xì)胞與細(xì)胞,操作手法,試劑的效價有密切的關(guān)系,消化時應(yīng)注意觀察細(xì)胞形態(tài),如細(xì)胞變得橢圓透亮,并且可以觀察到細(xì)胞與細(xì)胞間的間隙時,輕拍瓶身可以看見成流沙狀,即可中止消化,消化時盡量減少對細(xì)胞的吹打。

(4)、當(dāng)細(xì)胞*分離時,垂直放置培養(yǎng)瓶,讓細(xì)胞流到培養(yǎng)瓶的底部。在培養(yǎng)瓶中加入*培養(yǎng)基中止消化,計數(shù)并再次培養(yǎng)細(xì)胞。

(5)、對于無血清培養(yǎng)基,加入大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1(v∶v)0.25 mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性。


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